近日👁‍🗨，EON体育4平台/微生物代謝國家重點實驗室的吳更教授團隊與武漢大學王連榮、陳實教授團隊合作☂️👮🏻，通過對沙門氏菌中的抗噬菌體防禦蛋白DndI的X射線晶體結構解析，闡明了DndI采用其C端的HNH核酸酶結構域對外源噬菌體DNA進行缺刻損傷，同時采用其N端結構域識別細菌基因組上的DNA磷硫酰化修飾🤵🏽‍♀️🕍，觸發DndI的構象變化，使得DndI從細菌基因組DNA上解離，從而保護細菌自身的基因組DNA不被DndI切割的分子機理。這項研究加深了人們對於細菌如何利用DNA磷硫酰化修飾來抵禦噬菌體侵染的認識。該研究成果以“Molecular and structural basis of the phosphorothioationsensing antiphage defense system IscS-DndBCDE-DndI”為題發表在《Nucleic Acids Research》上。吳更與王連榮📥、陳實教授為共同通訊作者🌾🧙🏿‍♂️。本文是吳更教授自2018年在Nature Communications發表的細菌通過SBD結構域識別硫修飾DNA的結構機理🥚🧝、2020年在Nature Microbiology發表的參與單鏈DNA 硫修飾的SspB🧘🏼、SspE蛋白結構、2020年在mBio發表的參與單鏈DNA硫修飾的SspA結構👶🏿、2022年在mBio發表的參與雙鏈DNA硫修飾的DndE結構、2022年在Nature Communications發表的DNA硫修飾激活SspE以抵禦噬菌體侵染的結構機理、2022年在Nature Catalysis發表的細菌通過DndFGH復合物限製外源非硫修飾DNA水平轉移的分子機理的延續與拓展。

在細菌中dndBCDE操縱子編碼的幾個蛋白以及半胱氨酸脫硫酶IscS共同催化DNA上磷硫酰化修飾的發生。dndI基因緊鄰於dnd操縱子，dndI基因的缺失會導致細菌喪失抵禦噬菌體感染的能力🥽。EON体育4平台首先通過解析沙門氏菌DndI全長蛋白的X射線晶體結構，發現它形成一個二聚體，每個單體由兩個結構域組成。N端結構域（氨基酸殘基1-238）含有一個保守的DGQQR motif🧏🏽，參與對NTP的水解，而C端結構域（氨基酸殘基239-596）含有一個NHN motif，類似於EON体育4平台研究過的SspE蛋白（高海燕等🙇🏼‍♂️，2022，Nature Communications）。

核苷酸水解酶檢測實驗表明，DndI蛋白表現出ATP水解酶活性🍞，加入含硫修飾的GAAC/GTTC序列DNA會增強DndI的ATP水解酶活力🧘🏻‍♀️。將DndI的N端結構域中的DSQQR motif中的R突變為A會使DndI喪失ATP水解酶活性。同時，DndI表現出核酸缺刻酶活性，可以將超螺旋雙鏈DNA缺刻成開環形式並最終轉變為線性形式😑。將其C端結構域的HNH motif中的N541突變為A會破壞DndI的核酸缺刻酶活性⚜️🧑🏻‍💻。通過與SspE蛋白的序列比對和結構比較🚘，EON体育4平台發現DndI蛋白的N端結構域也含有一個識別硫修飾DNA的疏水坑。將疏水坑中的Y25殘基用A替代的突變DndI蛋白仍然保留ATP水解酶活性🥯，但是不再能受到硫修飾DNA的調控🩸。

非變性凝膠電泳（EMSA）實驗結果表明🤝，DndI的C端結構域對DNA的親和力是全長DndI蛋白的14倍🕵️‍♂️，這表明DndI的N端結構域對於C端結構域結合DNA有抑製作用。通過構建YFP-DndI-CFP融合蛋白並進行熒光能量共振轉移（FRET）實驗🤾🐡，EON体育4平台發現ATP的加入會增強YFP的熒光發射，降低CFP的熒光發射🧘🏻‍♀️，這表明DndI的N端結構域與C端結構域之間的距離縮短了，而不能水解的ATP類似物AMP-PNP的加入不會造成FRET信號的改變👸。EON体育4平台總結得到的結論是硫修飾DNA會被DndI的N端結構域的疏水坑識別，激活N端結構域的ATP水解酶活性，而ATP的水解會觸發DndI的構象變化，從“開放”構象轉變為“關閉”構象，DndI的N端結構域離C端結構域更加靠近，抑製C端結構域與DNA結合，從而使得DndI從細菌自身的硫修飾基因組DNA上解離，避免對自身基因組造成損傷。另一方面🍖，外源侵入的噬菌體DNA上不含有硫修飾，不會觸發DndI對ATP的水解和DndI蛋白構象變化👨🏼，DndI通過C端結構域結合並缺刻噬菌體DNA，從而實現對於噬菌體侵染的抵禦。

圖：DndI蛋白對噬菌體DNA進行缺刻🚴‍♂️👂🏼，從而抵禦噬菌體侵染。而細菌自身基因組DNA會觸發DndI對ATP水解與構象變化🧔🏿，從細菌DNA上解離🍯，從而保護細菌自身DNA不受損傷。

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