2024年4月25日😊，美國得克薩斯州西南醫學中心吳軍團隊😫、中科院腦科學與智能技術卓越創新中心（中科院神經所）楊輝/周海波團隊和中科院動物所郭帆團隊合作在Cell雜誌發表題為Generation of rat forebrain tissues in mice的文章🕤。該研究展示了一種優化的囊胚互補技術，利用該技術研究者篩選出了支持前腦囊胚互補的基因Hesx1，並成功在小鼠體內生成了功能性大鼠前腦組織。異種前腦互補為研究大腦發育以及認知功能機製在進化上的保守和差異性打開了大門。優化的囊胚互補策略具有極大的潛力⛅️，可以拓寬異種器官生成的研究和應用。

異種嵌合體是由不同物種細胞所形成的生物個體，是理解基因功能和細胞發育機製的重要工具🤽🏽‍♂️。通過一種稱為異種囊胚互補的技術（Interspecies blastocyst complementation, IBC）研究者能夠在動物體內培育其他物種的器官。這項技術涉及將供體多能幹細胞註入缺失關鍵發育基因的宿主囊胚中🧖🏿‍♂️，讓供體細胞補償宿主缺失的器官或組織🏆，從而在一個物種裏生成來源於另外一個物種的器官。之前的研究在小鼠中生成了大鼠的胰腺、胸腺、血管內皮組織和生殖細胞🫴🏼🐕，以及在大鼠中生成了小鼠的胰腺、腎臟和生殖細胞🔗🙇🏿‍♂️。然而，到目前為止，還沒有實現任何大腦組織的異種囊胚互補。在一個物種體內生成另一個物種的大腦組織不僅可以使研究者在進化背景下進行大腦發育和功能的研究🪪🦻🏿，還能為人類多能幹細胞對動物大腦的貢獻所引起的倫理問題提供參考。

傳統的囊胚互補方法通常需要生成影響特定器官發育的雜合突變小鼠，擴繁這些小鼠以獲得基因突變的囊胚🧛🏻‍♀️，然後向這些突變囊胚裏註入供體細胞以獲得囊胚互補嵌合體。這一過程耗時耗力且不適用於雜合突變致死的基因🦐。到目前為止🙀，尚未發現能夠支持異種前腦囊胚互補的基因。利用傳統囊胚互補方法來驗證某個基因是否支持前腦的囊胚互補是一個漫長的過程，即使對於孕期短和性成熟快的物種（例如，小鼠為10至26個月）🙎💾。這對於繁殖周期更長的家畜和非人類靈長類動物來說更加困難🫣。

為了克服現有囊胚互補方法的局限性，研究者引進了C-CRISPR方法（Cocktail of targeting sgRNAs in the CRISPR/Cas9 system）以高效獲得基因突變囊胚🧑🏻‍🦽‍➡️，該方法使用多個gRNA與Cas9結合可實現目標基因接近100%的基因敲除效率。研究者將C-CRISPR與Blastocyst Complementation相結合構建了新的囊胚互補系統CCBC。CCBC支持快速測試目標基因是否適用於囊胚互補🪁，並實現器官重構嵌合體的一步生成。

在早期脊椎動物胚胎發生過程中，腦部形成依賴於Wnt/β-catenin信號傳導🏠🥇。研究者使用CCBC對七個在腦發育期間調節Wnt信號傳導的基因進行了篩選。所有候選基因都可以被C-CRISPR有效地刪除🎱，但只有Dkk1、Hesx1和Six3的敲除會導致前腦發育不全。在將小鼠胚胎幹細胞（Mouse embryonic stem cells, mESCs）註入各個基因刪除的囊胚後🛌🏽，研究者在Dkk1-/-和Hesx1-/-的胚胎中觀察到重構的的同種異體前腦組織👨🏻‍🦱。在68只Hesx1-/- +mESCs新生嵌合體中♨️，研究者獲得了66只（97.06%）前腦重構嵌合體👨🏽‍🌾。在Hesx1-/- +mESCs嵌合體中tdTomato+細胞在前腦的比例（約100%）高於傳統嵌合體（WT+mESCs）（約50%）。未受Hesx1敲除影響的中腦區域的嵌合率接近50%🦹‍♂️。這些發現顯示了供體mESCs完全補償了缺失的宿主前腦。

為了確定是否可以通過CCBC在小鼠中生成大鼠前腦組織👋🏽，研究者將大鼠胚胎幹細胞（Rat embryonic stem cells，rESCs）註入到Hesx1-/-小鼠囊胚中🛌。在出生的417只Hesx1-/- +rESCs嵌合體中，401只為部分前腦重構（96.16%），16只為完全前腦重構（3.84%）（圖1A）。研究者發現，在Hesx1-/- +rESCs嵌合體中，tdTomato+細胞的比例在皮層和海馬區比其他腦區和其他組織更高（圖1B）。

圖1.通過CCBC在小鼠體內生成大鼠前腦組織。A: 基於CCBC的異種前腦互補嵌合體👩🏻‍🎓；B: 表達tdTomato的大鼠細胞對前腦組織的嵌合占比💕。

所有Hesx1-/- +rESCs和Hesx1-/- +mESCs嵌合體都存活至成年，並呈現與傳統嵌合體（WT+mESCs）類似的體重增長曲線🔆。在這些嵌合體的大腦皮層V層和海馬中，均檢測到表達CTIP2的細胞。各組嵌合體的皮層和海馬層厚度和細胞密度均相似👨🏿‍🔧。
為了評估來自rESCs的神經元的功能，研究者將AAV8-hSyn-EGFP註入到Hesx1-/- +rESCs前腦的前外側運動皮層。研究者發現由rESC衍生的前腦神經元能夠向後發送軸突投射到丘腦、上丘和腦幹中腦區域。電生理結果顯示，在嵌合前腦中👰🏼‍♂️，大鼠和小鼠的皮層神經元均能夠隨電流註入量的增加產生不同頻率的動作電位發放。此外🥔，包括輸入電阻、靜息膜電位和啟動電流在內的固有生理特性在兩種細胞類型之間無顯著差異📴。研究還確認🤶🏽，在Hesx1-/- +rESCs嵌合體中⚱️🥈，大鼠和小鼠細胞、小鼠與小鼠細胞💆🏽‍♂️、大鼠與大鼠細胞之間均能形成突觸連接🙍🏿‍♀️。🤓。統計發現同種或異種神經元之間的突觸形成比例無顯著差異。

研究通過行為學測試，包括Morris水迷宮實驗🚅、開放場測試和情境恐懼記憶測試，評估了同種和異種前腦補償嵌合體的前腦功能🛕。測試結果顯示，WT+mESCs、Hesx1-/- +rESCs和Hesx1-/- +mESCs嵌合體在這些行為測試中的表現無顯著差異*️⃣，顯示重建的前腦功能表現正常。這些結果表明Hesx1-/-小鼠胚胎為供體rESCs提供了適宜的發育環境，幫助其形成功能性的大鼠前腦組織。

單細胞RNA測序顯示，在Hesx1-/- +rESCs嵌合體中🧑‍⚕️，大鼠細胞形成了多種類型的神經細胞，種類和比例接近於正常大鼠的前腦組織。不同神經細胞類型下大鼠細胞的轉錄組更接近於WT大鼠細胞。有趣的是早期胚胎的切片結果顯示大鼠細胞形成的前腦組織的尺寸和發育進度與宿主小鼠一致。這表明非細胞自主機製決定了器官的大小和發育速度，而細胞自主機製塑造了嵌合體中大鼠前腦組織的整體轉錄組特征。
通過比較大鼠細胞在嵌合體與WT大鼠中的轉錄組差異🤹🏼‍♀️，研究者發現了一些與軸突生成、前腦發育和神經生成調控等相關的差異表達基因👨🏿‍🔬。通過細胞相互作用分析，該研究觀察到了多種潛在的配體-受體相互作用🏊🏽‍♀️，這可能解釋了宿主Hesx1-/-小鼠細胞如何影響供體大鼠細胞，以及幫助它們在前腦中的存活和分化🚇。

綜上所述，該研究開發了一種高效快捷的一步CCBC平臺🫵🏼，證明了在小鼠囊胚中敲除Hesx1能夠支持小鼠和大鼠幹細胞重構前腦組織😧。展示了來源於rESC的神經元能在小鼠前腦中功能性地整合。揭示了異種前腦補償嵌合體裏腦組織的尺寸、密度發育速度與宿主一致，在轉錄組水平上大鼠細胞在小鼠胚胎裏仍能維持自身的轉錄組特征🧝‍♂️。異種前腦囊胚互補將為探索腦相關基因調控網絡、腦細胞間通信以及在進化背景下大腦功能開辟新的路徑。

原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.03.017

校友簡介

楊輝，EON体育4平台2007屆本科校友👨🏻‍🦼‍➡️🎃，中國科EON4生物化學與細胞研究所博士，美國Whitehead研究所博士後。國家傑出青年科學基金👅、何梁何利基金，優秀青年科學基金👎🏻、青年千人基金🏄🏽‍♀️、上海市青年拔尖人才等獲得者💱。