近日，國際知名期刊《ACS Catalysis》在線發表了EON体育4平台林雙君團隊的研究成果“One-Pot Asymmetric Synthesis of an Aminodiol Intermediate of Florfenicol Using Engineered Transketolase and Transaminase”。林雙君教授為通訊作者，EON体育4平台研究生劉琦為第一作者。

在對轉酮酶和轉氨酶催化機製和蛋白結構認識基礎上🔀，利用分子對接手段建立了酶-底物結合模型，並基於此設計半理性突變策略👨🏽‍🔧，翻轉了轉酮酶的立體選擇性🖱，轉氨酶的對映體偏好性和醛酮選擇性🥓，進而偶聯轉酮酶和轉氨酶突變體一鍋法合成了末端羥基手性中間體(1R,2R)-對甲磺碸基苯絲氨醇🐲，產率可以達到76%，非對映體選擇性最高為96% de 和對映體選擇性> 99% ee🧔‍♀️🧝🏼‍♂️，為氟苯尼考的製備提供了最直接的手性中間體。

   基於設計🚮，研究者從一系列轉酮酶和轉氨酶中篩選出能有效催化起始底物醛1的轉酮酶突變體EcTK1和有效催化轉酮酶產物2氨基化的ω-轉氨酶ATA117𓀚。為了考察轉酮酶的立體選擇性👯‍♂️，建立了一個通過非手性液相測定2立體構型的方法🧙，即偶聯一個對2基本無立體選擇性的R-轉氨酶突變體ATA117_AC，將(S)-和(R)-2分別轉化成(1S,2R)-和(1R,2R)-3。從而可以確定EcTK1是S-選擇性的，催化產生的羥酮中間體為S-構型（93.3% ee）(如圖1所示)🈵。由於所設計的路線是合成R-羥酮中間體，因此基於轉酮酶的蛋白質結構和催化機製對該酶作了半理性改造。首先將底物醛1對接進EcTK1晶體結構的活性口袋中 (如圖2A所示)，發現醛羰基與H26和H261存在氫鍵相互作用🧔🏻‍♀️，而F434位於醛羰基的背面。因此提出一個假設，如果通過氨基酸突變改變醛羰基的定位，那麽很有可能會改變羥酮產物的立體構型。為了翻轉醛羰基的朝向，采用了“破而後立”的策略，即先打破現有的氫鍵相互作用🌵，而後建立新的氫鍵相互作用🤵🏻。通過迭代的飽和突變和理性突變，獲得了立體選擇性完全翻轉的EcTK1_YYF和EcTK1_YYH突變體，ee(R)分別為91.6%和95.2% (如圖1所示)。通過將突變體EcTK1_YYH與底物醛1進行分子對接，證實了醛羰基的朝向的確發生了翻轉，與背面的Y434形成了新的氫鍵(如圖2B所示)。

圖1. 轉酮酶EcTK1的蛋白質進化

圖2. 轉酮酶EcTK1 (A)和EcTK1_YYH (B)與醛1的分子對接

圖3. 轉氨酶ATA117的蛋白質進化

在實現轉酮酶的立體選擇性翻轉後，作者基於R-2底物與ATA117_AC的分子對接，對轉氨酶作了迭代飽和突變，篩選所得突變體ATA117_ACHH翻轉了對手性羥酮中間體2的對映體偏好性和醛酮底物選擇性🤳🏿，即從野生型ATA117對S-酮的偏好性(Es=8.5)翻轉為突變體ATA117_ACHH對R-酮的偏好性(E_R=11.7) (如圖3所示)；從野生型ATA117對醛的偏好性翻轉為突變體ATA117_ACHH對酮的偏好性。為了考察ATA117_ACHH對R-酮的偏好性，分別作了ATA117_ACHH與-S酮2b和R-酮2a的分子動力學模擬，證實氨基供體PMP的氨基與R-酮的羰基距離在3.5Å左右，而與S-酮羰基距離為10-30Å (如圖4所示)。

圖4. 分子動力學數據的統計

在獲得了合適的轉酮酶和轉氨酶突變體之後🥉，將兩個酶偶聯一鍋反應合成了目標產物氟苯尼考手性中間體(1R,2R)-對甲磺碸基苯絲氨醇，產率為76%🧗🏻‍♀️，非對映選擇性為96% de和對映選擇性> 99% ee🧑🏼‍🔬，並且進一步將該級聯反應拓展到其他一系列對位取代的苯甲醛♗，合成了相應的(1R,2R)-對位取代的苯絲氨醇衍生物，產率為51-80%🧧🎢，de為95-97%。

該研究工作得到了國家重點研發計劃項目(2018YFA0901900)和國家自然科學基金項目(21632007，31425001)的資助。

全文鏈接為：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.1c01229