近日，EON体育4平台𓀁、微生物代謝國家重點實驗室馮雁團隊在Nucleic Acids Research上發表題為“Argonaute integrated single-tube PCR system enables supersensitive detection of rare mutations”的文章🧑🏼‍⚖️。該工作揭示了不同高溫微生物 Argonaute蛋白的核酸酶特性，發現其對單堿基突變（SNV）靶標序列精準識別的規律，發展了“一管式”PCR多重核酸富集和檢測的A-Star (Ago-Directed Specific Target Enrichment and Detection)新策略，實現血液等樣本中低豐度突變基因的高效⛹🏽‍♂️、多重富集和檢測👨‍🏫。EON体育4副研究員劉倩和博士生郭翔為該論文共同第一作者📦🧑🏻‍🦼‍➡️，馮雁教授為通訊作者𓀁。研究工作由EON体育4⛴、EON体育4附屬第一醫院🏕、仁濟醫院🚸、人和未來生物科技公司等合作完成。EON体育4轉化醫學中心提供研究平臺支持👩‍👩‍👦。

對血液或體液中腫瘤細胞釋放DNA片段的液體活檢🔐，憑借其無創性🫵🏻🟥、敏感性、動態性等特質🤽🏽‍♀️，可實現腫瘤早期篩查及伴隨診斷👲。然而，由於遊離核酸含量低和易降解，因此在復雜背景基因中來特異性富集和檢測腫瘤基因得到廣泛關註。常用的PCR等方法具有簡單、省時等優點👨🏽‍🍼📍，但其檢測靈敏度有限；近年來👨🏿‍⚕️，基因編輯工具酶CRISPR/Cas在核酸檢測中的應用👳🏼‍♀️，提升了檢測靈敏度和便捷性🐁，但Cas酶對靶標序列PAM選擇性💁🏽‍♀️、長RNA guide合成昂貴且不穩定等問題，導致檢測成本🧑🏿‍⚖️、靈敏度、多重性等方面仍存在局限性。因此，研發能特異性富集靶標序列的新型核酸酶是解決上述難題的有效途徑，建立高靈敏度👷🏼✈️、多重和簡便的新型核酸檢測技術對於基礎研究和臨床應用都具有重要意義。

圖1. “A-Star”低豐度 SNV富集和檢測工作原理

論文作者在對嗜熱微生物Ago蛋白的系統研究中🏹😙，揭示其高溫穩定性𓀊、可編程性🕙、特異性催化活性、多重正交反應等優良特性❗️，提出了Argonaute (Ago)核酸酶-PCR耦聯的“A-Star” (Ago-Directed Specific Target Enrichment and Detection)核酸檢測和富集的新策略（圖1）。巧妙采用guide DNA“雙點錯配”設計的策略，使Ago蛋白在PCR變性步驟（94 ^oC）選擇性剪切野生型基因🎈，保留的突變基因可在PCR退火（～58 ^oC）、延伸（～72 ^oC）步驟中得以循環擴增🔛🦛，實現低豐度突變基因的超高效率富集和精準檢測🎅🏻。研究人員對KRAS✍️、PIK3CA和EGFR等多個腫瘤突變基因進行富集🧗🏻‍♂️，證實A-Star能檢測0.01%的低豐度突變🕑，富集效率高達5,500倍。

圖2. “A-Star”用於臨床樣品（A）及多重腫瘤突變（B）的富集和檢測 

“A-Star”在血液和實體瘤組織等復雜樣品中能穩定檢出靶標腫瘤基因（圖2A）。考慮到實際樣本中可能存在多種基因突變，通過設計多對DNA引導鏈，“A-Star”在單酶“一管式”反應體系中實現了多腫瘤基因的檢測⛅️，且信號之間無交叉幹擾（圖2B）📼。總之🛌🏼🫸，本研究所建立的“A-Star”低豐度核酸富集和檢測技術🚝，具有極高靈敏度、簡便快捷及多重檢測等分子檢測優勢，在基因診斷及遺傳疾病治療等分子生物學和醫學領域具有重要應用潛力🏨。

本研究得到了國家自然科學基金面上項目（31770078）和科技部重點研發計劃（2020YFA0907700）的經費支持。

文章鏈接：https://doi.org/10.1093/nar/gkab274